Помощничек
Главная | Обратная связь


Археология
Архитектура
Астрономия
Аудит
Биология
Ботаника
Бухгалтерский учёт
Войное дело
Генетика
География
Геология
Дизайн
Искусство
История
Кино
Кулинария
Культура
Литература
Математика
Медицина
Металлургия
Мифология
Музыка
Психология
Религия
Спорт
Строительство
Техника
Транспорт
Туризм
Усадьба
Физика
Фотография
Химия
Экология
Электричество
Электроника
Энергетика

Фосфитный триэфирный метод



В 1970-х гг. в практику был введен фосфиттриэфирный метод образования межнуклеозидных связей, в котором были использованы существенно более реакционноспособные нуклеозидные производные на основе P(III), первоначально хлорофосфиты.[26] Позже, группа под руководством М. Карузерса (M. Caruthers) использовала менее агрессивные и более селективные 1H-тетразолидофосфиты и реализовала метод в твердофазном варианте.[27] Вскоре после этого сотрудники из той же группы улучшили метод путём использования в качестве строительных блоков более стабильных нуклеозидных амидофосфитов. Замена менее практичной метильной защитной группы фосфата[28][29][30] на более удобную 2-цианэтильную группу[31] дала тот вариант нуклеозидных амидофосфитов, который является стандартом реагентов для синтеза олигонуклеотидов и по настоящее время. Многочисленные дальнейшие усовершенствования методов синтеза мономерных блоков, олигонуклеотидных синтезаторов и протоколов сборки и деблокирования превратили амидофосфитный подход в очень надёжный и производительный метод получения синтетических олигонуклеотидов.[1]

Тиофосфатные олигонуклеотиды и их синтез

Тиофосфатные олигонуклеотиды — это модифицированные олигонуклеотиды, в которых один из атомов кислорода в фосфатном остатке замещен на атом серы. Широко используются только те тиофосфаты, в которых сера не является связующим звеном между нуклеозидным остатком и атомом фосфора. В этом случае замена кислорода на серу приводит к образованию нового центрахиральности на атоме P(V), поэтому в простейшем случае динуклеотида образуются SP- и RP-диастереомеры. В n-мерном олигонуклеотиде, в котором все (n-1) межнуклеотидных связей являются тиофосфатными, число диастереомеров составляет 2(n-1). Будучи неприродными аналогами нуклеиновых кислот, олигонуклеотидные тиофосфаты значительно более устойчивы к гидролизу нуклеазами, классом ферментов, расщепляющих нуклеиновые кислоты путем гидролиза P-O-связи фосфодиэфирного мостика. Это свойство определяет использование тиофосфатов в качестве антисмысловых олигонуклеотидов в приложениях in vivo и in vitro, где неизбежно воздействие нуклеаз. Подобным образом, чтобы увеличить стабильность малых интерферирующих РНК, часто вводят, по крайней мере, одну тиофосфатную связь в 3'-положение смысловой и антисмысловой цепи. В оптически чистых олигонуклеотидных тиофосфатах диастереомеры, в которых все фосфорные центры имеют SP-конфигурацию, более устойчивы к ферментативному гидролизу, чем их RP-аналоги. Однако, синтез оптически чистых тиофосфатов сложен. В лабораторной практике обычно пользуются смесями диастереомеров.

Синтез олигонуклеотидных тиофосфатов аналогичен синтезу природных олигонуклеотидов. Различие заключается в том, что стадия окисления заменяется реакцией сульфурирования. Кэпирование в данном случае проводится после сульфурирования. Для введения серы применяются три коммерчески доступных реагента:

· 3-(Диметиламинометилиденамино)-3H-1,2,4-дитиазол-3-тион (DDTT) обеспечивает высокую скорость сульфурирования и обладает стабильностью в растворе.[

· Реагент Бокажа (Beaucage Reagent) имеет более высокую растворимость в ацетонитриле и обеспечивает протекание реакции за более короткое время. Однако, он имеет ограниченную стабильность в растворе и менее эффективен при сульфурировании связей РНК.

· N,N,N',N'-Тетраэтилтиурамдисульфид (TETD) растворим в ацетонитриле, однако, реакция сульфурирования межнуклеозидной связи ДНК занимает 15 мин, что в 10 раз медленнее, чем в случае двух предыдущих соединений.

Автоматизация

Ранее олигонуклеотидный синтез проводился вручную в растворе или на твёрдой фазе. Твердофазный синтез был реализован с использованием миниатюрных стеклянных колонок, снабжённых пористыми фильтрами. В настоящее время твердофазный синтез проводится автоматически на олигонуклеотидных синтезаторах, управляемых компьютерами. Он может быть реализован в колоночном, планшетном или чиповом формате. Колоночный формат подходит для исследовательских или крупномасштабных целей, для которых высокая производительность не является критичной. Планшетный формат разработан специально для высокопроизводительного синтеза в малом масштабе для удовлетворения растущей потребности производства и науки в синтетических олигонуклеотидах. Различные виды синтезаторов коммерчески доступны.

Пост-синтетическая обработка

После завершения сборки цепи олигонуклеотид полностью защищён:

· 5'-концевая гидроксильная группа защищена DMT-группой;

· межнуклеозидные фосфатные группы защищены 2-цианэтильными группами;

· экзоциклические аминогруппы во всех нуклеиновых основаниях, кроме T и U, защищены ацильными защитными группами.

Для получения целевого олигонуклеотида необходимо удалить все защитные группы. Защита оснований и цианэтильные защитные группы обычно удаляются одновременно при обработке неорганическими основаниями или аминами. Применение данного метода, однако, ограничено тем, что при такой обработке в качестве побочного продукта образуетсяакрилонитрил. В условиях снятия защитных групп акрилонитрил может алкилировать азотистые основания, в основном, N3-положение тимина и урацила с образованием 2-цианэтильных производных по реакции Михаэля. Образования этих побочных продуктов можно избежать обработкой олигонуклеотидов, связанных с твердофазным носителем, растворами оснований в органическом растворителе, например, 50%-ым триэтиламином в ацетонитриле или 10%-ым диэтиламином в ацетонитриле. Такая обработка рекомендуется для синтеза в большом и среднем масштабе. Когда синтез проводится в малом масштабе, концентрация образующегося акрилонитрила в деблокируюшем растворе низка, и предварительное удаление цианоэтильной группы не является обязательным.

Как правило, олигонуклеотиды, связанные с носителем, обрабатывают по одной из двух схем:

· Наиболее часто 5'-DMT-группа удаляется в конце синтеза, а олигонуклеотиды снимаются с носителя и деблокируются под действием водного аммиака, водного метиламина, их смесей, газообразных аммиака или метиламина, реже растворами других первичных аминов и щелочей при комнатной либо повышенной температуре. Такая обработка удаляет все защитные группы с 2'-дезоксиолигонуклеотидов, давая конечный продукт в растворе. В случае 2'-O-силилзащищённых олигорибонуклеотидов добавляется стадия удаления силильных защитных групп под действием фторид-иона. Незащищённый продукт используется без дальнейшей очистки или очищается одним из нижеследующих методов. При грубой очистке, олигонуклеотид обессоливается осаждением в этанол, гель-фильтрацией или обращённо-фазовой ВЭЖХ. Тонкая очистка проводится с целью удаления укороченных (кэпированных) и модифицированных последовательностей; для этого олигонуклеотиды очищают электрофорезом в полиакриламидном геле или анионно-обменнойВЭЖХ с последующим обессоливанием.

· Второй подход используется, если целевой олигонуклеотид планируется очищать посредством обращённо-фазовой ВЭЖХ. В этом случае 5'-концевая DMT-группа сохраняется и в дальнейшем служит в качестве гидрофобной метки. Олигонуклеотид деблокируется в основных условиях, как в первом подходе, и после упаривания очищается обращённо-фазовой ВЭЖХ. При этом его подвижность значительно отличается от подвижности кэпированных последовательностей благодаря наличию дополнительной гидрофобной группы, что упрощает его выделение в чистом виде. DMT-группа затем удаляется в кислой среде, например, 80%-ой водной уксусной кислоте в течение 15-30 мин при комнатной температуре. Затем раствор упаривают и обессоливают, как описано выше.

· При необходимости, в олигонуклеотид вводят дополнительные 5'-модификации, например нерадиоактивные метки, используя одну из пост-синтетических методик.

 




©2015 studenchik.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.